赵贞吉听闻三大殿灾，于是写信给执政严嵩，认为不应为了修殿而劳苦百姓，因此惹恼严嵩。赵贞吉的父亲赵勣谢世，他闻讣后归乡，升任南京户部右侍郎，因已闻讣归，遂未到职。严嵩欲遣其往蓟州掌督运粮草之事，赵贞吉以为此事原已有人司职，徒增一职无益于事，故而拒绝，严嵩大怒，使人论劾，竟夺官去职，罢官归乡后，赵贞吉于内江桂湖街聚众讲学，从者甚众，并遍游内江各名胜寺庙，题诗刻石。

朱厚熜驾崩，赵贞吉痛哭，称：“先皇知我。”，新即位的穆宗朱载坖，起复赵贞吉为礼部侍郎兼翰林院学士，掌詹事府事务。朱载垕亲临太学，当时国子祭酒胡杰刚离职，赵贞吉代其处理事务，讲《尚书·大禹谟》之《后克艰章》篇。赵贞吉年逾六十，议论侃直，进止有仪，颇受朱载垕关注，朱载垕又见其阐发有旨，音畅仪端，深为感动。不久后，赵贞吉补任经筵日讲官，被推举为南京礼部尚书，又将赵贞吉留下，当经筵直讲。会文武边臣议，欲招南兵十万于张家湾，赵贞吉执意认为不可，当事者悟，复点会试总裁，奉命教吉士，仍充讲读编修，代祭孔子，为皇太子讲《唐太宗喻太子章》。

赵贞吉以礼部尚书兼文渊阁大学士，入参机务，同诸阁臣入辅大政，协管詹事府事，加太子太保、荣禄大夫，赐蟒袍鸾带。由首辅李春芳举荐，兼掌都察院事，会有俺答孙把汉阿吉等入降，赵贞吉力促和议，后因非例考察科道之事与辅臣高拱不协，上疏乞归，解都察院事。

赵贞吉致仕归家，荫一子赵鼎柱为左府都事，抵家后，门人请设教于圣水寺。隆庆和议成，朱载垕以赵贞吉曾与其议，特荫其子赵景柱为中书舍人。朱载坖驾崩，赵贞吉哭临至水浆不入，因哀毁过度而患嗽疾，其弟赵蒙吉谢世，赵贞吉伤弟之先逝，有迟暮之感，乃于是年卜葬地于“宝峰”。赵贞吉杜门谢客，不复会讲，汇秦汉而下三教遗言，作为内篇曰《经世通》，外篇曰《出世通》，汇三千年未经折衷之籍，聚为一书，作内外二篇都序。此书尚未撰成，至冬末，嗽疾复作，遂辍编，端坐而逝，享年六十九岁，讣闻抵京师，神宗朱翊钧为之辍朝一日，谕祭褒扬，谥号“文肃”，追赠少保。