蔡伦出身于东汉初年大凑山下从事冶铸的一个铁匠世家，他的祖上是打铁的。卫飒上任桂阳郡太守后，在桂阳设置铁官，蔡家因此与朝廷官员有了紧密的联系。

小时候，他在大凑山麓一处被称作石林的乡学启蒙读书，习《周礼》，读《论语》，尤其对周边的生产、生活环境很感兴趣，比如冶炼、铸造，种麻、养蚕。少年蔡伦，已经是满腹经纶，很有才学。

根据蔡伦后人的传说，蔡伦是在18岁以后，由京城到桂阳管理调运采冶铸铁的官员推荐，才进皇宫做了宦官。这一年，是汉明帝永平十八年（公元75年）。从史料分析，蔡伦是中国华南地区甚至江南地区第一位走进朝廷，进入皇宫为官的人。

他被选入宫后，开始是在皇宫旁舍嫔妃所居的掖庭当差，几年后提升为出入皇宫、传递诏令的小黄门宦官。蔡伦的才华越来越显露出来。系奉窦皇后之命监管宋贵人之事，建初七年，窦后设计诬陷宋贵人，蔡伦“验实”。到汉和帝即位时（公元89年），升迁为出入朝廷、侍从天子的中常侍，豫参帷幄之中，成了传达诏令、掌理文书、参预朝政的高等宦官。

汉和帝刚登上皇帝宝座时，年龄尚幼，蔡伦曾服侍过的窦皇后成为皇太后，把持朝政，皇权旁落外戚窦氏家族。窦太后的同胞窦宪等四个兄弟都为显贵，擅威权，谋不轨，炎势倾朝野。心性秉直的蔡伦看不惯这些，便与大宦官钩盾令郑众首谋，扶助和帝，乘窦宪出征班师回朝之机，收窦宪大将军印，清除了窦氏专权的弊端，巩固了和帝的皇权统治。永元九年（公元97年），“监作秘剑及诸器械”；此前，由中常侍“加位尚方令”。

蔡伦兼任尚方令时，掌管尚方，这是一个主管皇宫制造业的机构，“尚方宝剑”就是尚方制作的宝剑，后来成为最高权力的象征。因史书记载阙如，如今已无从考证这个任命是怎么发生的，但这无疑是中国历史上最正确的任命之一。当时的皇宫作坊，集中了天下的能工巧匠，代表那个时代制造业最高水准，为蔡伦提供了一个极好的平台，他的个性、爱好以及他在工程技术方面的过人天资，在这个工作岗位上得到井喷式的展现。

永元九年（公元97年）尚方制作的刀剑等器物，“莫不精工坚密，为后世法”。也就是说，他大幅度改进了制作工艺，达到极高水准，并长期居于技术的顶峰。晚蔡伦三四十年的崔寔在《政论》中写道：“有蔡太仆之弩，及龙亭九年之剑，至今擅名天下。”“蔡太仆”、“龙亭”，指的都是蔡伦，他已成为兵器“品牌”。

改进造纸术时的蔡伦主管监督制造宫中用的各种器物。他挑选出树皮、破麻布、旧渔网等，让工匠们把它们切碎剪断，放在一个大水池中浸泡。过了一段时间后，其中的杂物烂掉了，而纤维不易腐烂，就保留了下来。他再让工匠们把浸泡过的原料捞起，放入石臼中，不停搅拌，直到它们成为浆状物，然后再用竹篾把这粘乎乎的东西挑起来，等干燥后揭下来就变成了纸。蔡伦带着工匠们反复试验，试制出既轻薄柔韧，又取材容易、来源广泛、价格低廉的纸。